Qual é o melhor fornecedor de fluorescência vegetal?

Construir sistemas avançados de fluorescência para medição da biomassa do plancton, fisiologia e fotosíntese em laboratórios e oceanos

1. Objetivos e conteúdo da pesquisa

Objetivos da pesquisa

O objetivo do projeto é construir um pequeno instrumento de mesa chamado de sistema de indução de fluorescência F I e precursor R (mini-FIRe) para análise de amostras discretas e medição contínua da abundância e fisiologia do plancton no oceano. Ao contrário dos fluorescômetros FRRF e FIRe da geração anterior inventados e desenvolvidos pela equipe de Rutgers, o novo instrumento mostrará uma sensibilidade melhorada (cerca de 10 vezes) que fornecerá mais parâmetros fisiológicos em tempo real. do novo instrumento.AltoA sensibilidade torna-os de grande valor para o trabalho de campo em alto mar.

Conteúdo da pesquisa

Avaliação da atividade fotosintética de plancton e outros organismos fotosintéticos usando técnicas de fluorescência variável- A avaliação rápida e sem danos do estado fisiológico dos organismos fotosintéticos depende do uso de fluorescencia de taxa de repetição rápida (FRRF) e suas técnicas de indução de fluorescência seguida e relaxamento (FIRE). A tecnologia foi inventada e desenvolvida pela equipe da Rutgers. A metodologia básica para avaliar a sobrevivência biológica da fotossíntese depende da medição e análise do perfil de "fluorescência variável" da clorofila, que é uma característica do organismo fotossíntese * (revisado por Falkowski et al. em 2005). A tecnologia de "fluorescência variável" depende da relação entre a fluorescência da clorofila e a eficiência do processo de fotossíntese e fornece um conjunto abrangente de parâmetros de fluorescência e fotossíntese para o organismo. As medições ópticas são sensíveis, rápidas e sem danos e podem ser feitas em tempo real e in situ.

Esta abordagem e os princípios instrumentais implementados foram estabelecidos na literatura revisada por pares (Falkowski and Kolber 1995; Kolber et al., 1998; Gorbunov et al., 2000, 2001; Gorbunov and Falkowski 2004). Originalmente desenvolvido para estudar o plancton em colunas de água, a tecnologia FRR forneceprecisoInformações sobre o funcionamento das comunidades de plancton e os efeitos dos fatores ambientais que controlam a produtividade primária dos oceanos (por exemplo, Falkowski e Kolber 1995; Falkowski e Raven 2007; Behrenfeld et al., 1996; Coale et al., 2004; Falkowski et al., 2004). O uso de fluorescômetros FRR e FIRe de mesa e mergulho tornou-se parte integrante da maioria dos projetos de biooceanografia nos Estados Unidos e no mundo.

Tecnologias de indução de fluorescência I e precursor R (FIRe) foram desenvolvidaspara medir um conjunto abrangente de características fotossintéticas e fisiológicas de organismos fotossintéticos (Gorbunov and Falkowski 2005) . A tecnologia FIRe baseia-se no registro e análise de transientes de fluorescência causados por uma série de flashes excitados que controlam com precisão a intensidade, a duração e os intervalos (Figura 1 e Gorbunov and Falkowski 2005). A tecnologia fornece um conjunto abrangente de parâmetros que caracterizam o processo de iluminação por fotossíntese, a fotoquímica no sistema de luz II (PSII) e a transferência de eletrões para a fixação de carbono por fotossíntese. Como esses processos são particularmente sensíveis aos fatores ambientais, a tecnologia FIRe fornece a base para identificar e diagnosticar fatores de estresse naturais (restrições nutricionais, fotoquímica e estimulação fotográfica, estresse térmico, etc.) e humanos (como poluição).

Figura 1. Exemplo de instantâneo de fluorescência FIRe. A dinâmica da produção de fluorescência é registrada em resolução de tempo de microssegundos, incluindo quatro fases:(umFase, 100 ms) Impulsos curtos fortes de 100 ms (chamados de flash de ciclo único, STF) são usados ​​para PSII saturado acumulado e medir a indução de fluorescência de Fo a Fm (STF): (Fase 2, 500ms) Luz modulada fraca é usada para registrar a energia dinâmica relaxante da produção de fluorescência em uma escala de tempo de 500ms: (Fase 3, 50 ms) Impulsos longos fortes de duração de 50ms (chamados de flash de ciclo múltiplo, MTF) são usados ​​para saturar PSII e bibliotecas de PQ: (Fase 4, 1 s) Luz modulada fraca é usada para registrar a dinâmica da reoxidação da biblioteca de PQ em uma escala de tempo de 1s. A análise da fase 1 é fornecida: mínimo e atéGrandeProdução de fluorescência (Fo, Fm); Eficiência quântica Fv/Fm (STF) da separação de cargas fotoquímicas do PSII; seção transversal funcional do PSII, σPSII; O fator de conexão (p). A fase 2 fornece uma constante de tempo para a transmissão eletrônica do receptor PSII (ou seja, reoxidação lateral do receptor Qa). A fase 3 fornece Fm (MTF) e Fv/Fm (MTF). A fase 4 revela a constante de tempo de transferência de eletrônicos entre o PSII e o PSI (reoxidação da biblioteca PQ).

Antecedentes biofísicos da tecnologia de fluorescência variávelA temperatura ambiente, a fluorescência da clorofila é produzida principalmente no PSII. Quando o centro de reação PSII está aberto (oxidação de Qa), a produção de fluorescência é extremamente pequena, Fo. Quando o Qa é reduzido (por exemplo, por exposição a luz intensa), o centro de reação é fechado e a produção de fluorescência aumenta para seus altos níveis de Fm. Para detectar Fo e Fm, a técnica FIRE registra a indução de fluorescência causada por um intenso pulso de luz saturada (~ 100 μs, conhecido como flash de ciclo único, STF) (Figura 1 Fase 1). A taxa de indução de fluorescência é proporcional à seção transversal de absorção funcional do PSII, enquanto a amplitude relativa do aumento da fluorescência Fv / Fm é definida pela eficiência quântica da fotoquímica do PSII. A forma da indução de fluorescência é controlada pela transferência de quantidade de excitação entre unidades de fotossíntese individuais e definida pelo 'fator de conexão' (Kolber et al. 1998). Assim, na ausência de transferência de energia (p = 0), a indução de fluorescência é exponencial e torna-se anti-curva quando p aumenta para o máximo de ~0,5 a 0,7.

A energia cinética da transferência de eletrões do lado do receptor PSII (ou seja, a reoxidação Qa) foi avaliada por meio de análise pré-dinâmica fluorescente após STF (Figura 1, Fase 2). A dinâmica fluorescente é composta por várias partes, porque a velocidade de reoxidação Qa depende do estado do segundo receptor de eletrões Qb, que funciona como um receptor móvel de dois eletrões:

Qa- Qb → Qa Qb- (150 - 200 ms) (1)

Qa- Qb- → Qa Qb= (600 - 800 ms) (2)

Qa- _ → Qa- Qb → Qa Qb- (~ 2000 ms) (3)

A resposta (3) corresponde às condições em que o Qb foi inicialmente desligado do local de ligação à proteína D1. Além disso, um pequeno número de centros de resposta de desativação com transmissão de eletrônicos danificados pode ajudar a prevenir os componentes mais lentos da dinâmica. O software FIRe utiliza análise de 3 componentes para processar a dinâmica precursora para recuperar a constante do tempo de transferência de eletrões (ou seja, Q oxide tQa).

A constante de tempo de transferência de eletrões entre o PSII e o PSI, tPSII-PSI, foi recuperada a partir da análise dinâmica precursora de fluorescência após o flash multi-rotação (MTF, fases 3 e 4 na Figura 1). Na maioria das condições fisiológicas, esta constante de tempo é determinada pela velocidade de reoxidação da biblioteca de quinona de protoma (PQ) e é uma ordem de quantidade mais lenta do que o tQa.

A medição de uma série de parâmetros de fluorescência FIRE de luz ambiental intensa pode reconstruir a taxa de transmissão de eletrônicos por fotossíntese, Pf， Como função da intensidade da luz (fotosíntese e curva da intensidade da luz) (Kolber e Falkowski, 1993). Pf é proporcional à produção quântica fotoquímica (DF'/Fm') do produto de iluminação e da medição sob luz ambiental. A análise dessas curvas de fotossíntese e intensidade da luz forneceu fotossíntese para grandes taxas de transmissão de eletrões (Pmax) e coeficientes de saturação fotográfica (Ek). A fotossíntese e a medição de radiação são realizadas usando a fonte de luz fotoquímica (ALS) FIRe, controlada por computador através do software de coleta de dados FIRe.

Antecedentes e conhecimento especializadoOs membros da equipe Rutgers acumulam mais de 20 anos de experiência no desenvolvimento de técnicas e métodos de fluorescência variável. Eles inventaram e desenvolveram instrumentos* para mais de 10 estudos biofísicos (veja a lista de referências anexas para publicações relevantes avaliadas por pares).

2. Apresentação do instrumento

O mini-FIRE baseia-se nos mesmos princípios biofísicos do instrumento FIRE de mesa anterior (Gorbunov and Falkowski 2005), mas o novo instrumento é 3 vezes mais compacto e 10 vezes mais sensível. O limite inferior de concentração de clorofila é baixo até ~0,005 mg/m3, o que torna o mini-FIRE valioso para amostragem de campo em alto mar.

Aqui, a equipe de Rutgers propôs a construção de um mini-FIRe (Figura 2) que seria usado para análise de amostras discretas (por exemplo, amostras coletadas de garrafas de ouro de Nice no local) e / ou amostragem contínua no oceano. O instrumento será equipado com uma câmara de amostras de fluxo para desenhar continuamente a biomassa do plancton e as propriedades fotossínteses. Abaixo está uma lista de parâmetros fisiológicos do registro mini-FIRE e especificações técnicas do instrumento mini-FIRE (Figura 2). O instrumento será usado para análise de amostras discretas (por exemplo, amostras coletadas de garrafas de ouro de Nice no local) e / ou amostragem contínua no oceano. O instrumento será equipado com uma câmara de amostras que flui para desenhar continuamente as propriedades da biomassa e da fotossíntese do plancton. Aqui está uma lista de parâmetros fisiológicos e especificações técnicas do instrumento para o registro mini-FIRE.

Figura 2 Fluorescência mini-FIRe, com sensibilidade aumentada.

Parâmetros de medição:

Produção mínima e máxima de fluorescência após adaptação escura (Fo, Fm)

Rendimento fluorescente eficaz, mínimo e máximo sob adaptação à luz (F', Fo', Fm') *

● Produção quântica eficaz fotoquímica em sistemas ópticos II e PSII (Fv/Fm e DF'/F m))

Área de absorção PSII funcional em três comprimentos de onda (sPSII)

Eficiência de transferência de energia entre as unidades fotossínteses ('fator de conexão')

Constante de tempo de transmissão de eletrões do lado do receptor PSII (Q a a Qb, Qa a Qb-)

Constante de tempo de transferência de eletrões para fotossíntese entre PSII e PSI

• velocidade de transmissão eletrônica, ETR， Como função de intensidade da luz *

● Coeficiente de temperação fotoquímica (qP) e coeficiente de temperação não fotoquímica (NPQ) *

● Até grandes velocidades de fotossíntese, inclinação inicial e tempo de rotação para fotossíntese (obtido a partir das curvas F e E)

Estes parâmetros são medidos usando uma fonte de luz fotoquímica (ALS) e registrados como curvas de intensidade da luz.

Especificações técnicas do sistema mini-FIRe:

Sensibilidade: 0,005 - 100 mg/m3 de clorofila a (a concentração de amostragem pode ser aumentada adicionando filtros de redução de densidade neutra)

● Fonte de luz de excitação: azul (comprimento de onda pico de 450 nm, largura de banda de 30 nm), verde (comprimento de onda pico de 530 nm, largura de banda de 40 nm), laranja (comprimento de onda pico de 590 nm, largura de banda de 30 nm) para estimular seletivamente o plancton de diferentes grupos funcionais.

Detecção de emissão: 680 nm (clorofila a) e 880 nm (clorofila bacteriana a), outros comprimentos de onda podem ser selecionados usando filtros de emissão substituíveis.

Dimensões: 10 x 5 x 12 polegadas